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近年來，細胞外囊泡（EV）研究正加速發(fā)展。2011年約有200篇相關論文發(fā)表，但2016年一年就有1000篇以上的相關論文發(fā)表，論文內容涉及各種生理功能

和病理癥狀。EV大致可分為核內體來源的外泌體和細胞膜來源的微囊泡，但即便是用現(xiàn)在提取精度最高的差速離心法也難以將二者明確分離，所以簡單地將

10,000×g離心后未沉淀的EV稱為Small EV（主要是外泌體）1）。外泌體是由各種細胞分泌的小型膜囊泡（直徑30~100 nm），存在于大多數(shù)體液（如血液、

尿液、髓液等）和細胞培養(yǎng)液中。外泌體是由脂質雙分子層包被的膜囊泡，產(chǎn)生于稱為多囊泡胞內體的胞內囊泡中，多囊泡胞內體通過與細胞膜融合將外泌體

釋放到細胞外。外泌體含核內體來源的蛋白質（例如ESCRTs等）和細胞內運輸相關蛋白（例如Rab GTPase等）、以及細胞膜來源蛋白（例如CD63、CD81等）

等為代表的各種分泌細胞來源的蛋白和RNA，同時還含分泌細胞的細胞膜來源和內體膜來源的脂質（如膽固醇和鞘磷脂等）2）。多年來研究人員認為外泌體的

作用是參與細胞內廢棄物的排放。但是近年來外泌體在生物體內作為運載脂質、蛋白質、RNA等細胞間信息傳遞的新型媒介倍受矚目。除了闡明外泌體生理或

病理功能外，面向于臨床應用的功能研究也迅速發(fā)展，尤其是診斷、治療和生物標記物開發(fā)等。

現(xiàn)在，外泌體研究橫跨幾乎所有的研究領域（免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤、內分泌、循環(huán)系統(tǒng)等）。例如，免疫細胞來源的外泌體含有抗原肽/MHC復合體和各種抗

原，可能控制著免疫細胞間抗原信息的交換、免疫細胞活化、非活化等各種免疫應答機制3）。外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)中與神經(jīng)回路的控制相關4），同時各種神經(jīng)退

行性疾病的致病蛋白還可以通過外泌體釋放到細胞外并傳遞到其他細胞，與病情發(fā)展密切相關5）。癌細胞釋放的外泌體含有大量與血管新生和免疫抑制相關的

分子，構建適合癌細胞生長的微環(huán)境，促進癌細胞的發(fā)展6）。另外，癌細胞來源的外泌體上的粘著分子表達形式?jīng)Q定著癌癥向器官的轉移途徑7）。最近，有報

告指出脂肪細胞釋放的外泌體對肝臟的遺傳基因表達有控制作用8）。許多病毒利用外泌體的產(chǎn)生路徑感染細胞，受病毒感染的細菌和寄生蟲通過外泌體控制其

他受細胞感染的細菌、寄生蟲的活動9、10）。

上述這些功能幾乎都是通過細胞分泌到外泌體中的分子引起的。其中，自從在外泌體內發(fā)現(xiàn)分泌細胞來源的mRNA和miRNA后，外泌體參與細胞間基因表達信

息的水平轉移的可能性備受矚目11）。這些RNA被外泌體的脂質雙分子層膜所保護，不會被RNase所降解，可以在血液和體液中穩(wěn)定存在。被靶細胞吞噬的外

泌體通過與內體膜融合，將RNA釋放到靶細胞的細胞質中。釋放出來的mRNA除了被翻譯為蛋白質，還通過miRNA抑制靶基因的翻譯，使得外泌體在靶細胞內

調控基因表達。一個外泌體所含的蛋白質有數(shù)萬種，mRNA、miRNA的種類有數(shù)千種以上，這些分子的組成因來源細胞的不同而異，也會根據(jù)細胞的狀態(tài)而變

化。另外，外泌體中這些物質的結構與它們在分泌細胞內的結構不同，所以可能存在一種外泌體特異蛋白和mRNA/miRNA選擇性積累的機制。這種特異性可將

外泌體內的RNA作為生物標記，更進一步作為治療開發(fā)的靶點。外泌體中的mRNA一旦被靶細胞吞噬，可能會引發(fā)該細胞內的功能性蛋白的表達，但外泌體中

大部分的miRNA是前體而非功能性miRNA，這些miRNA具有何種生理性意義，學者們還在積極研究。由于外泌體含有各種蛋白質、RNA和脂質，研究人員正

將其按細胞進行分類匯總，以建立數(shù)據(jù)庫?ExoCarta。此外，在世界各地分別運用蛋白質組學、轉錄組學和系統(tǒng)生物學進行大規(guī)模分析工作，而FunRich的

EVplugin已成為一種通用的分析手段。今后，在推進外泌體研究方面，各個研究領域的信息共享至關重要。

運用外泌體研發(fā)治療方法和診斷方法

近年來，隨著外泌體的功能逐漸闡明，越來越多的研究著眼于開發(fā)運用外泌體功能的治療方法。例如，血液中的成纖維細胞（間充質祖細胞的一種）所釋放的

外泌體，可以通過促進角質細胞的遷移、增殖和血管新生來促進傷口愈合。報告指出，外泌體內的促血管生成miRNA、抗炎性miRNA和促膠原蛋白沉淀miRNA

等參與了上述過程12）。從癌癥患者樹突狀細胞中釋放的外泌體含有各種癌癥細胞來源的蛋白質，可以強化殺傷性T細胞對癌癥細胞的特異性反應。利用此功能

的抗腫瘤免疫療法，目前正處于初期臨床研究階段13）。另一方面，也有研究嘗試利用外泌體的功能抑制發(fā)病機制。例如，類風濕關節(jié)炎患者的滑膜成纖維細

胞所釋放的外泌體，聚集了高濃度誘導細胞死亡的TNF-α，可使類風濕關節(jié)炎惡化14）。通過上述介紹可以知道癌癥細胞來源的外泌體含有與癌癥進展相關的

分子，神經(jīng)細胞來源的外泌體含有與神經(jīng)退行性疾病相關的分子，因此通過抑制或去除這些外泌體，有望抑制疾病發(fā)生。隨著研究的不斷發(fā)展，還會擴大外泌

體的功能闡明和臨床應用的適應性，有望將外泌體應用于各種疾病的治療。此外，還可嘗試利用外泌體將siRNA和抗癌藥劑等運輸?shù)侥繕思毎?。將各種細胞

粘著分子表達在外泌體膜表面上，由其形式?jīng)Q定外泌體被運往哪一種細胞，該特性有望用于開發(fā)新型DDS15）。外泌體在體液中十分穩(wěn)定，同時外囊泡所含的

蛋白質和RNA被外泌體的脂質雙分子層膜所包被而免于降解。另外從收集后長期儲存的體液中所提取到的外泌體仍然比較完整，因此外泌體有望成為臨床檢測

的新型疾病生物標記。外泌體與各種疾病的相關性已經(jīng)查明，特別是釋放到血液中的癌細胞來源的外泌體，與健康細胞來源外泌體和組成分子的差異性備受矚

目，并作為癌癥早期的診斷工具，被研究其與癌癥發(fā)展的相關性16）。此外，尿液中的外泌體有望作為腎臟、前列腺疾病和膀胱疾病的新型診斷標記，腦脊液

中的外泌體作為腦部腫瘤和神經(jīng)退行性疾病的新型標記。

外泌體研究的課題和展望

盡管目前已有許多關于外泌體作用的報導，但是在這些驗證實驗中使用了從體液和培養(yǎng)細胞上清中純化的高濃縮外泌體，所以可能無法反映它們在活體內的真

實性狀。因此，目前尚未闡明該現(xiàn)象是否在活體內真實發(fā)生了。確認外泌體生理作用的唯一方法就是明確外泌體的釋放機制，通過促進或抑制釋放機制，分析

會引起何種生理現(xiàn)象，這也是進一步研究發(fā)展的方向。甚至生物體內的外泌體動態(tài)（哪個外泌體遷移至何處）也會在今后的研究開發(fā)中成為重要的研究課題。

截止目前為止，外泌體純化的方法主要有超速離心法和PEG沉淀法，但利用這些方法提取的外泌體中混有非常多的雜質，必須慎重分析所獲得的實驗結果是否

是由外泌體組成成分所引起的。并且超離法存在操作繁雜、回收率不穩(wěn)定、不能用于定量分析、必須使用昂貴的超速離心機、無法進行多樣品分析檢測等問題

，因此外泌體的研究相對困難，需要盡快開發(fā)可簡單純化高純度外泌體的技術。因此FUJIFILM Wako著眼于巨噬細胞的外泌體受體Tim4，制備出Tim4細胞外

域與磁珠結合的“Tim4磁珠”17）。由于Tim4以鈣離子依賴性方式與外泌體膜表面的磷脂酰絲氨酸（PS）結合，因此用含有螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA）的

洗脫緩沖液可將結合的外泌體釋放出來，從而獲得高純度的完整外泌體。實際上，用Tim4親和法純化的人白血病細胞釋放的外泌體，其純度與超離法和PEG沉

淀法純化的外泌體相比，可檢測出10~100倍以上的外泌體特異性蛋白，并且?guī)缀鯖]有外泌體以外的雜質，由此證明通過該方法可以重復性良好地純化高純度外

泌體。因此，該方法可以檢測大量目前為止無法檢測的外泌體上的蛋白和RNA。利用Tim4對外泌體的強結合能力，可用ELISA或FACS高靈敏度檢測和定量外泌

體。此外，以往只能用差速離心法粗略純化的微囊泡，通過運用Tim4親和法，可實現(xiàn)高純度純化微囊泡。本指導書中對這些技術進行了詳細說明，我們期待這

項技術的有效性受到世界各方好評，并有望貢獻于外泌體和微囊泡的生理功能的分析研究。

外泌體的檢測和分離的難點，以及外泌體的分類方法多樣，導致研究人員尚未統(tǒng)一定義以何種方法純化的細胞外囊泡可以稱為“外泌體”，如何進行實驗數(shù)據(jù)的

解釋和再現(xiàn)性的確認是一項難題。近年隨著國際細胞外囊泡協(xié)會（ISEV）的設立、世界性研究者研討會的形成，國際標準的MISEV指南的提案，計劃進行和開

始進行EV研究的研究人員請務必閱讀這些方針18、19）。另外為了規(guī)避上述的混亂情況，還建立了記錄各論文實驗條件的EV-TRACK knowledge database20）。

一方面隨著EV研究倍受矚目，各國也啟動了大型研究項目。美國啟動NIH戰(zhàn)略性大型項目Extracellular RNA Communication，國際權威性會議?Gordon會

議和Keystone Symposia也于2016成立小組會。受歐洲藥物研究開發(fā)公司“創(chuàng)新藥物倡議組織（IMI）”的支持推進的CANCER-ID項目也包含了EV研究。2017

年日本選定了EV研究為文部科學省研究開發(fā)戰(zhàn)略的目標之一，期待會加速研究發(fā)展。無論如何，未來EV研究的發(fā)展，需開發(fā)可成為其研究基礎的穩(wěn)定的研究

方法和技術，期望Tim4親和法可成為其中之一。

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FUJIFILM Wako可提供外泌體生產(chǎn)、純化、檢測、分析一站式相關產(chǎn)品。

外泌體分離和純化試劑盒

MagCapture? 外泌體提取試劑盒PS Ver.2

MagCapture? 外泌體提取試劑盒PS Ver.2可以從細胞培養(yǎng)上清、血清、血漿 等樣品中高純度且簡便快捷地純化外泌體等細胞外囊泡。通過應用以鈣離子依賴

方式與細胞外囊泡表面的磷脂酰絲氨酸（PS）結合的Tim4，并使用螯合劑實現(xiàn)完整的細胞外囊泡純化。

純化細胞外囊泡專用RNA提取試劑盒

純化細胞外囊泡（EV）用microRNA Extractor? Kit

純化細胞外囊泡（EV）用microRNA Extractor? 試劑盒可以使用離心柱從外泌體等細胞外囊泡（Extracellular  Vesicle：EV）中提取包含microRNA在內的總

RNA。只需少量洗脫液（20 μL）即可回收高濃度的RNA，因此 適用于二代高通量測序（Next Generation Sequencing，簡稱NGS）。

使用MagCapture? 外泌體分離試劑盒PS Ver.2分離外泌體后，提取RNA并進行NGS分析。

外泌體高靈敏度定性分析

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PS Capture? 外泌體流式試劑盒是一款通過運用與磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結合的Tim4蛋白和磁珠的PS親和法，可將外泌體固定在磁珠上，并使用流式

細胞儀高靈敏度檢測標記蛋白的試劑盒。

※ 使用前需自行準備表面標記蛋白對應熒光染料標記一抗、或一抗以及熒光染料標記二抗。

外泌體檢測用ELISA試劑盒

※1：檢測用二抗會與人、小鼠、大鼠的IgG發(fā)生非特異性反應，因此不可用于檢測血清、血漿。 

※2：試劑盒提供的抗體為抗人CD63抗體，因此對人以外的實驗對象進行檢測時需要另外準備合適的抗體。

※3：如使用的不是去除外泌體的FBS，則需要另外檢測FBS來源的PS陽性外泌體。

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